EBER是EB病毒编码的小RNA, 是该病毒的表达产物, 在被感染的细胞核中以高拷贝数存在。许多肿瘤性疾病与其感染密切相关, 例如鼻咽癌、NK/T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴上皮瘤样癌等。近年来, 临床病理诊断越来越依赖原位杂交技术检测病毒是否存在, 但是实验过程耗时较长, 涉及不同工作温度。目前大多商品试剂盒的主要设备是恒温培养箱, 而利用原位杂交仪尚未普及。本文根据该技术的操作特点, 将原位杂交仪的操作程序优化后用于该技术并将其应用效果与恒温培养箱作比较。

1 材料与方法

1.1 材料

来自福建医科大学附属协和医院病理科, 并且已经明确诊断。其中鼻咽癌3例, NK/T细胞淋巴瘤9例、霍奇金淋巴瘤2例、淋巴上皮样癌6例。每例切片2张, 厚度3μm, 然后随机抽取, 将两张切片分别标记为手工组和仪器组。手工组的变性杂交操作在恒温培养箱进行, 仪器组在原位杂交仪上进行, 其余步骤一致。

1.2 主要试剂和仪器

组织细胞原位杂交试剂盒 (福建泰普生物科学有限公司) ;Statspin Thermo Brite原位杂交仪;DNP-9052型电热恒温培养箱。

1.3 方法

两组切片的前期处理相同, 常规烤片脱蜡, 水化, 甩干切片, 将组织周围液体用滤纸吸干, 然后滴加适量蛋白酶K (与PBS按1:25的比例混匀, 现用现配) 室温消化5 min, 蒸馏水洗涤, 无水乙醇干燥, 用标记笔在组织周围画圈。然后滴加适量探针杂交液, 手工组将玻片放入湿盒用恒温培养箱55℃孵育80 min, 结束后调整温度, 待温度降至37℃, 杂交过夜, 而仪器组直接在原位杂交仪上, 运行已设定好的程序即55℃孵育80 min, 然后37℃杂交过夜。仪器自动运行。之后PBS冲洗, 滴加EBER一抗 (A液) 、B液, C液, 分别孵育30、20、30 min, 每个步骤后均用PBS冲洗3次, 3 min/次。最后进行DAB显色和常规苏木素复染、封片。

1.4 判读标准

杂交阳性信号位于细胞核内, 呈棕褐色。

2 结果

在显微镜下观察实验结果, 通过比较可以看出:手工组20张切片均观察到阳性信号位于细胞核中, 为棕褐色, 呈深染, 容易辨认, 非特异性背景少。仪器组20张也均呈阳性, 镜下效果与手工组相似。

3 讨论

根据原位杂交原理, 应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对原则进行特异性结合而形成杂交体, 再利用与标记物相应的检测系统进行显示处理, 从而达到检测目的。这一技术具有很高的敏感性和特异性。Khan[1]认为, 原位杂交技术是组织学材料中检测EB病毒的金标准, 在检测时具有定位作用, 能够确定病毒与组织和细胞的关系。在确定与疾病的关系时, 原位杂交已成为公认的标准方法[2]。虽然此技术过程比较繁琐, 但与蛋白水平检测相比, 具有明显的优越性, 其关键步骤在于变性杂交过程。在整个实验过程中, 利用恒温培养箱进行变性杂交可以看出:在55℃孵育结束后, 需要人为二次设定温度并且只有等到温度降到37℃之后才能进一步操作, 这过程需要消耗一定时间。而利用原位杂交仪, 事先设定好程序, 仪器可以在55℃孵育结束后自动降至37℃, 降温快, 不需要人为二次设定温度。所以, 经过比较作者认为, 恒温培养箱虽然作为病理科技术室的重要设备, 其成本低, 应用范围广, 已在基层医院普及, 但在进行EBER原位杂交时, 利用恒温培养箱人工操作步骤较多, 周围环境温度等条件也容易影响操作过程, 延长整个实验的时间, 进而可能影响结果, 导致重复性不够理想。而原位杂交仪虽然仪器成本较高, 不易在基层医院普及, 但操作简单, 程序灵活多变, 结果稳定, 重复性好, 应作为首选设备。